Protéinase K fiable pour les travaux de biologie moléculaire

La protéinase K est une endopeptidase à large spectre très populaire en biologie moléculaire.
Pourquoi et comment améliorer la fiabilité de son usage ?

1. Activité enzymatique de la protéinase K

La protéinase K n’a pas de spécificité de substrat significative, et le site de clivage principal est la liaison peptidique à l’extrémité carboxyle, avec une préférence pour les acides aminés aromatiques et hydrophobes. Elle hydrolyse aussi les esters [Saenger].

Son spectre de digestion est ainsi très large, que ce soit pour les substrats (quasi toutes les sortes de protéines et polypeptides), mais aussi le pH (de 4 à 12) et la température (de +37°C à +65°C).

L’activité de la protéinase K n’est pas affectée par de nombreux agents, notamment le thiocyanate de Guanidine, l’urée, le Triton-X100, le Tween20, le citrate, l’acide iodoacétique, l’EDTA et d’autres inhibiteurs de protéases à serine tels que le TLCK et le TPCK. Cependant l’effet est plus ambigu, notamment avec les agents chaotropes selon les substrats (polypeptides ou protéines complexes) et les conditions de protéolyse (concentration, température).
Par ailleurs l’EDTA, un chélatant, complexe les ions Ca2+ qui ne peuvent plus alors se fixer sur les 2 sites présents sur la protéinase K. Bien que le Ca2+ n’affecte pas directement l’activité enzymatique, la présence ou absence d’EDTA peut affecter la reproductibilité des expériences. De plus, le calcium protège la DNase I contre la protéinase K [Tullis].

Enfin, les conditions optimales de réaction de la protéinase K sont variables : de 45°C à 65°C, pH 7,5 à pH 11. Ceci pourra être imputé à la source de l’enzyme (purifiée ou recombinante), à la concentration et la formulation du tampon, ou la température et le pH combinés. La protéinase K s’autolyse partiellement à faible concentration (<0,01mg/mL), mais elle est bien stable à >1mg/mL.

2. Utilisation en Biotech / Biologie Moléculaire

Les caractéristiques de l’activité enzymatique présentées ci-dessus rendent la protéinase K très efficace pour digérer les protéines dans de nombreuses applications :

• Biologie – biochimie
  Elimination efficace des protéines des solutions d’acide nucléique pour PCRs
  Inactivation des RNases/DNases endogènes lors d’extractions d’acides nucléiques
  Localisation d’enzymes. Protease footprinting
• Diagnostic par biologie moléculaire
  Isolement d’ADN et ARN hautement natifs (non endommagés)
  Démasquage d’épitope sur des coupes de tissus pour IHC
• Pharmaceutique et BioPharma
  Purification de vaccins basé sur des gènes (ADN ou ARN dans des plasmides ou adénovirus)
  Élimination d’endotoxines

Pour digérer les protéines d’échantillons d’acide nucléiques avant purification pour des technique de biologie moléculaire telle que la PCR , la protéinase K est en général utilisée en présence d’EDTA (nécessaire pour inhiber les enzymes dépendantes d’ions métalliques, telles que les nucléases), à une concentration de travail de 50µg/ml. Divers tampons de digestion sont possibles, dont avec 0.5% de SDS. Dans certaines applications, la protéinase K peut être combinée ou remplacée par la Pronase (à 1mg/ml), autre protéase à large spectre, qui agit dans les mêmes conditions.

La protéinase K est aussi utilisée pour de démasquage d’épitopes par pré-traitement enzymatique des coupes de tissus (fixé au formaldéhyde, ou paraffinées) en vue d’analyse immunohistochimique (IHC), alternativement à la trypsine.
Elle a aussi été utilisée pour la digestion de protéines de tissus de cerveau pour la recherche de prions de l’Encéphalopathie Spongiforme Transmissible (EST).

La Protéinase K est aussi utile dans des procédure pour éliminer les endotoxines liées à des protéines cationiques telles que le lysozymen, la ribonuclease A ou des Igs [Petsch].

3. Une protéinase K de qualité – fiable – qualifiée pour les applications biotech.

Dans les applications pré-citées, une protéinase K de qualité est requise afin d’obtenir des résultats optimaux. Interchim sélectionne des fabricants avec des spécifications strictes, notamment pour la biologie moléculaire, avec fabrication par synthèse recombinante. La Protéinase K Uptima™ est utilisée en routine dans beaucoup de laboratoires, pour des applications exigeantes comme la détection PCR par capture de séquence (100 fois plus sensible que la PCR classique) [Vokurka].

La stabilité de la solution à 20mg/mL, stérilisée et filtrée à 0,22µm, a été améliorée pour permettre un stockage à température ambiante. Il est toutefois recommandé de la stocker à 2-8°C pour un stockage à long terme.